Осознание устойчивости к антибиотикам как глобальной угрозы здоровью животных и людей стимулирует поиск альтернативных стратегий в области искусственного осеменения. Основная проблема заключается в эффективном угнетении роста патогенной микрофлоры без использования антибиотиков, минимизируя потенциальное повреждение спермиев.
Одним из таких решений является гипотермическое хранение спермы при полном отсутствии антибиотиков. Основная концепция опирается на хранение при температуре 5°С (против традиционных 17оС), что действует бактериостатически, с поддержанием бактериальной нагрузки ниже порогового уровня (его превышение повреждает спермии и негативно влияет на слизистую половых путей свиноматки).
Однако ключевой проблемой в отношении гипотермического хранения спермы является высокая чувствительность сперматозоидов хряка к низким температурам. Это связано с высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот и низким отношением стеарина к фосфолипидам в мембранах спермы. Несмотря на обнадеживающие результаты in vitro и высокую плодовитость в первом масштабном полевом исследовании, подтвержденном дальнейшим исследованиям in vitro, нужны более углубленные знания о потенциальное повреждение сперматозоидов, вызванное температурным стрессом. Холодовой шок приводит к летальному поражению незначительной популяции спермы, но, что важнее, его действие сопровождается большим сублетальным повреждением, нарушая функциональные параметры спермы, что трудно обнаружить обычным анализом.
Для оценки сублетального повреждения гипотермических спермиев хряка было проведено соответствующее исследование. В его рамках с помощью разноцветной проточной цитометрии сравнивали фертильность спермы, хранящейся с антибиотиками, со спермой, хранящейся в условиях пониженной температуры (5оС). Также было сделано микроскопическое типирование патогенов, отслежено количество и тип бактерий при длительном хранении при 5°C при отсутствии антибиотиков.
Ход исследования
Образцы спермы от девяти хряков с антибиотиками хранили в темноте при 17°C в течение 144 ч. Образцы без антибиотиков медленно охлаждали и хранили в течение такого же времени при температуре 5°С.
Подвижность спермы оценивали через 24, 72 и 144 ч. используя систему CASA AndroVision (Minitube, Германия) и фазово-контрастный микроскоп (Zeiss, Германия).
Свежую (нативную) сперму хряков и соответствующие образцы разбавленной спермы, хранившие в течение 0, 24, 48 и 72 ч., переносили из отдельных пробирок в стерильные кріофлакони с добавлением 20% глицерина для защиты клеток бактерий от колебаний температуры, а затем замораживали в жидком азоте. Замороженные образцы хранились при -80°C для дальнейших микробиологических исследований.
Общее количество бактериальных клеток в разбавленных образцах спермы определялось из десятикратного разведения. Объем 100 мкл каждого разведения высевали на агаровые пластины и инкубировали в течение 48 ч. при 37°С в аэробных условиях. Количество бактерий рассчитывали из двух разведений в двух экземплярах и выражали как колониеобразующие единицы на миллилитр (КОЕ/мл).
Для бактериальных изоляций 10 мкл расширенных образцов спермы с антибиотиком и без него высевали на планшет для микробной диагностики. После аэробной инкубации в течение 24 ч. при 37°с исходные пластинки агара крови повторно инкубировали в течение 24 ч с 5% СО2. В обоих случаях отдельные колонии были культивированы на одной и той же пластине и инкубированы в течение следующих 24 ч. при одинаковых условиях. Идентификация бактерий из чистых субкультур выполнялась по стандартным диагностическим процедурам и проводилась классическими биохимическими тестами, включая систему идентификации API от bioMérieux Deutschland (Германия) или анализ генов 16s рДНК.
Различные субкультуры были отнесены к трем основным группам (грамположительные кокки, грамположительные палочки, грамотрицательные бактерии) для сравнения через разнообразие видов бактерий и изолятов, которые нельзя классифицировать по роду или видовым уровнями. Среди них отдельно регистрировали бактериальные изоляты, которые вызывают беспокойство. Эта категория включала виды, которые могут негативно влиять на сперматозоиды или нести специфические риски в производстве спермы, такие как потенциальная бета-лактамаза расширенного спектра (ESBL) или бактерии производят биопленки, а также виды, которые могут вызвать бактериальные инфекции у свиноматок.
Результаты
Подвижность спермиев
Общая подвижность оставалась на высоком уровне в течение всего срока хранения, несколько более высокие значения были в образцах, хранившихся при 17°C по сравнению с 5°C (рис. 1). Общая подвижность колебалась от 89,2% ± 1,3% (24 ч.) до 87,7% ± 1,3% (144 ч.) для образцов, хранящихся при 17°C, и от 86% ± 1,6% через 24 ч. до 83,2% ± 1,3% через 144 ч. у образцов, хранившихся при 5°C.
Микробиология
Количество бактерий в образцах спермы девяти хряков представлено на рис. 2.
В образцах сырой спермы было определено 3647 ± 2296 КОЕ/мл (диапазон от 318 до 21 900 КОЕ/мл). Во время хранения в течение 72 ч. количество бактерий колебалось от 0 до 245 КОЕ/мл в образцах спермы с розбавником BTS (Minitube) с антибиотиком при 17°C, и от 0 до 773 КОЕ/мл в образцах, растворенных в Androstar Premium (Minitube), хранившиеся при 5°C без антибиотика.
Количество бактерий в разбавленной сперме уменьшилось между 24 и 72 ч. с 30 ± 27 до 5 ± 5,1 КОЕ/мл в образцах из BTS, которые хранились при 17°C (с антибиотиком), и с 244 ± 84,4 до 134 ± 51,7 КОЕ/мл при 5°C в образцам с Androstar Premium без антибиотика.
Во все промежутки времени количество бактерий была выше в образцах, не содержащих антибиотик, которые хранились при 5°С, по сравнению с образцами, хранившимися при 17°С с антибиотиком (Р < 0,05). Сырая сперма содержала в среднем 5,9 ± 0,7 различных субкультур (рис. 3). Среднее количество субкультур оставалось неизменным во время хранения в течение 72 ч. с большим числом образцов, хранившихся при 5°C (3,0 ± 0,2) по сравнению с образцами, хранившимися при 17°C (0,4 ± 0,1; P < 0,05). В образцах сырой спермы 50,9% субкультур было определено как грамположительные кокки, 28,3% — грамотрицательные виды (преимущественно неферментирующие бактерии) и 20,8% - грамположительные палочки (рис. 3).
Спектр оставался подобным в образцах с Androstar Premium без антибиотика при 5°C, но демонстрировал постоянное уменьшение грамположительных кокков наполовину до 72 час. хранение. В отличие от этого, образцы, хранившиеся в BTS с антибиотиком при 17°C, продемонстрировали переход в сторону грамотрицательных видов уже через 24 часа. (83,3%) до 100% через 72 ч. хранение. Грамотрицательные виды были идентифицированы как бактерии, принадлежащие к комплексу Burkholderia cepacia, и были выделены только из разведенных образцов, но не из сырой спермы.
Три других вида бактерий, которые могут вызывать беспокойство при искусственном осеменении, а именно Pseudomonas aeruginosa, Pasteurella sp. и Escherichia coli, были выделены из сырой спермы и из образцов с Androstar Premium без антибиотика. Подобным образом B. cepacia, P. aeruginosa (n = 6) были выделены через 72 ч. хранение при 5°C, между тем Pasteurella (n = 3) было обнаружено эпизодически через 24 часа. хранение и E. coli (n = 1) только сначала (0 ч).
Итак, хранения спермы хряков при температуре 5°C без использования антибиотиков является потенциальной альтернативой традиционному хранению при температуре 17°C с использованием антибиотика. Хранение при низкой температуре эффективно ингибирует рост бактерий в сперме хряков и поддерживает исходный спектр бактерий с потенциальной функцией в репродуктивной физиологии. В то же время достойны внимания соблюдение строгих гигиенических мероприятий в хозяйстве и регулярный мониторинг состояния здоровья животных, чтобы минимизировать бактериальную нагрузку в свежей сперме и избегать попадания патогенов. Влияние холодного шока на клеточную основу обнаружены на низком уровне и не влияли на результаты фертильности.
Проведение дальнейших исследований в разных условиях хозяйства рекомендуется для оценки эффективности предложенного метода хранения спермы. В целом концепция гипотермического хранения является перспективным инструментом противодействия увеличению устойчивости к антибиотикам в области искусственного осеменения свиней.
Более подробно о технологиях хранения спермы хряков без антибиотиков речь пойдет 27 мая во время вебинара, организованного компаниями Minitube (Германия) и БИОТЕСТЛАБ (Украина). Спикер-Рудольф Гроссфельд, доктор наук, консультант в области сперматологии животных, обработки спермы и искусственного осеменения. Коспикеры: Виктория Уильямс, региональный директор по продажам (Minitube) и Василий Смутко, консультант по искусственному осеменению животных (БИОТЕСТЛАБ). Участие-бесплатное. Регистрация — по ссылке https://biotestlab.clickmeeting.com/vebinar/register
Рис. 1. Оценка спермиев в образцах, сохраненных в разбавителе Androstar Premium при 17°C с антибиотиком (0,25 г/л гентамицина сульфата) и при 5°C без антибиотиков
а: по вертикали — Общая подвижность, %, по горизонтали — Срок хранения, час.
б: по вертикали — Жизнеспособные спермии, %, по горизонтали — Срок хранения, час. 24 72 144
Рис. 2. Наличие бактерий в сперме
а: вертикаль — КОЕ / мл, по горизонтали — Разбавленная сперма.
Raw Semen — нативная (свежая) сперма.
б: вертикаль — Колонии, по горизонтали — Разбавленная сперма.
17оС, BTS, с антибиотиком 5оС, Androstar Premium, без антибиотика
Рис. 3. Виды субкультур бактерий в сперме
Extended semen — разбавленная сперма
Raw semen — нативная сперма
H — час.
w / АВ — с антибиотиком
w / o АВ — без антибиотиков
Gram positive rods — грамположительные палочки
Gram positive cocci — Грамположительные кокки
Gram negative species — грамотрицательные виды
За материалами Journal of Animal Science and Biotechnology volume (2021 г.)
Биотестлаб:
 |
044 339-93-12 |
 |
info@biotestlab.shop |
 |
biotestlab.shop |
